Modelado y optimización de la clasificación de nanoporos inmunomagnéticos paralelizados para el aislamiento específico de marcadores de superficie de vesículas extracelulares de medios complejos

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13292 (2023) Citar este artículo

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El aislamiento de subpoblaciones específicas de vesículas extracelulares (VE) en función de su expresión de marcadores de superficie plantea un desafío importante debido a su tamaño a nanoescala (<800 nm), su expresión heterogénea de marcadores de superficie y la gran cantidad de VE de fondo presentes en muestras clínicas. (1010-1012 EV/mL en sangre). La clasificación nanomagnética altamente paralelizada utilizando chips de nanoporos magnéticos grabados en pista (TENPO) ha logrado una clasificación inmunoespecífica precisa con alto rendimiento y resistencia a la obstrucción. Sin embargo, todavía no se ha realizado un estudio sistemático de los parámetros de diseño que controlan las compensaciones en el rendimiento, la recuperación objetivo de los vehículos eléctricos y la capacidad de descartar los vehículos eléctricos en segundo plano en este enfoque. Combinamos simulación de elementos finitos y caracterización experimental de chips TENPO para dilucidar reglas de diseño para aislar subpoblaciones de vehículos eléctricos de la sangre. Demostramos la utilidad de este enfoque al reducir el fondo del dispositivo > 10 veces en relación con diseños publicados anteriormente sin sacrificar la recuperación de los vehículos eléctricos objetivo mediante la selección del diámetro de los poros, la cantidad de membranas colocadas en serie y el caudal. Comparamos los vehículos eléctricos aislados con TENPO con los métodos estándar de aislamiento de vehículos eléctricos y demostramos su utilidad para una amplia aplicación y modularidad al dirigirnos a subpoblaciones de vehículos eléctricos de múltiples modelos de enfermedades, incluidos el cáncer de pulmón, el cáncer de páncreas y el cáncer de hígado.

Las vesículas extracelulares (VE) son partículas membranosas a nanoescala (<800 nm) que contienen cargas de ácido nucleico y expresan proteínas de superficie que reflejan sus células de origen1. Debido a sus múltiples cargas y su capacidad para sortear barreras anatómicas como la barrera hematoencefálica para circular en fluidos corporales periféricos como la sangre (1010-1012 EV/mL)2 y la orina (1010 EV/mL)3, los EV se han convertido en una fuente prometedora de biomarcadores para el diagnóstico y caracterización de múltiples cánceres4,5,6,7,8,9, así como en otros contextos de enfermedades, incluidas las lesiones cerebrales traumáticas10 y las enfermedades infecciosas11. Además, los vehículos eléctricos desempeñan un papel mecanicista en procesos biológicos como la siembra metastásica12 y las interacciones tumor-inmunes en el cáncer13, así como en patologías que incluyen lesión cerebral traumática14, enfermedades autoinmunes15 y paro cardíaco16.

Actualmente, el estudio de los vehículos eléctricos y su potencial para el diagnóstico y la terapéutica se ve frenado por una tecnología que no fue diseñada para abordar su combinación única de tamaño, complejidad y cantidad a nanoescala en muestras biológicas. La alta concentración de vehículos eléctricos en la sangre plantea un desafío particular para los investigadores que buscan diferenciar una subpoblación de vehículos eléctricos específica de otras subpoblaciones de vehículos eléctricos, así como de otras partículas que no son vehículos eléctricos, como restos celulares en el mismo rango de tamaño («antecedentes» no relevantes) . Los métodos actuales de aislamiento de vehículos eléctricos, como la ultracentrifugación, los kits de precipitación comerciales (Thermo Fisher, System Biosciences) y la cromatografía de exclusión por tamaño, carecen de la selectividad y el rendimiento de los marcadores de superficie para clasificar con precisión las subpoblaciones de vehículos eléctricos17.

Del mismo modo, los métodos previamente establecidos para la clasificación de células por marcadores de superficie no pueden medir vehículos eléctricos a nanoescala ni lograr el rendimiento necesario para procesar la gran cantidad de vehículos eléctricos que normalmente se encuentran en muestras clínicas. Por ejemplo, procesar ~ 1011 EV en 1 ml de sangre no sería factible para la citometría de flujo celular de alto rendimiento. Los citómetros de flujo de nanopartículas típicos clasifican a una velocidad de ~ 1000 recuentos/segundo18, lo que requiere ~ 3 años para clasificar 1 ml de sangre, mientras que incluso los últimos sistemas de citometría de flujo subcelular que clasifican a ~ 60 000 eventos/segundo19 requerirían 19 días para 1 ml de sangre. sangre. Este desafío se ve amplificado por la baja expresión absoluta de proteínas de superficie en los vehículos eléctricos en comparación con las células debido al área de superficie dramáticamente aumentada de una célula de ~ 10 µm en comparación con un vehículo eléctrico de < 800 nm, lo que produce señales fluorescentes por debajo del nivel de detección para sistemas comerciales de citometría de flujo20. En respuesta a este desafío, se han desarrollado múltiples enfoques de microfluidos utilizando tamaños de características de micro/nanoescala del tamaño de un EV para realizar una clasificación de EV de precisión basada en el tamaño o por marcadores de superficie. Sin embargo, limitaciones como el requisito de nanofabricación compleja4,21,22, volúmenes de entrada máximos bajos23,24, dependencia de un único objetivo de biomarcador molecular25 o bajo rendimiento de muestra21 han obstaculizado la aplicabilidad del tamaño de microfluidos o la clasificación de EV de marcadores de superficie.

Para abordar las deficiencias de generaciones anteriores de dispositivos de microfluidos en el aislamiento de subpoblaciones de vehículos eléctricos, nuestro grupo ha desarrollado chips magnéticos NanoPOre (TENPO) Track-Etch para realizar la clasificación inmunomagnética paralelizada de vehículos eléctricos en función de sus proteínas de superficie5. Al expandir la paralelización de la clasificación inmunomagnética a millones de nanoporos magnéticos grabados en pistas, TENPO es resistente a fallas debido a obstrucciones en poros individuales porque una obstrucción hace que el líquido se redistribuya uniformemente a los millones de otros nanoporos magnéticos. Además, la operación paralela de millones de nanoporos aumenta el rendimiento y las tasas de flujo de muestra, ya que la velocidad del flujo individual por poro se puede mantener baja en función de la alta densidad de poros (> 107 poros/cm2 para d = 600 nm de poros5, > 106 para d = 3 µm de poros por Cytiva/Whatman). Por último, el grabado de huellas combinado con la deposición de vapor de una bicapa, que consiste en una capa magnética suave de NiFe y una capa de pasivación de Au, ofrece una fabricación económica de una gran cantidad de nanoporos magnéticos definidos con precisión, evitando al mismo tiempo la litografía costosa y difícil de escalar5.

Para aislar subpoblaciones de vehículos eléctricos específicos, los vehículos eléctricos primero se marcan con anticuerpos biotinilados específicos de los marcadores de superficie de interés y luego se conjugan con nanopartículas magnéticas (MNP) anti-biotina de 50 nm. Por lo tanto, los vehículos eléctricos que expresan en gran medida un marcador de superficie particular estarán fuertemente etiquetados con MNP en comparación con los vehículos eléctricos que expresan débilmente o no expresan el marcador de superficie (Fig. 1A, izquierda). Los complejos EV-MNP se empujan verticalmente a través de los nanoporos magnéticos usando una bomba de jeringa, y solo los EV que han sido etiquetados con una cantidad suficiente de MNP tendrán una fuerza magnetoforética lo suficientemente fuerte como para superar la fuerza de arrastre del fluido que fluye a través del poro (Fig. .1A, centro). A diferencia de las mediciones basadas en luz, que están limitadas en la escala de longitud por la longitud de onda de la luz, la magnetostática no está limitada en la escala de longitud5,26 y se ve favorecida por la falta de magnetismo de fondo significativo en los fluidos corporales periféricos, como la sangre y la orina. En el flujo de trabajo de TENPO, los vehículos eléctricos capturados se lisan para la cuantificación de proteínas o ácidos nucleicos posteriores (Fig. 1A, derecha), o se eluyen completos para la caracterización de vehículos eléctricos (por ejemplo, análisis de seguimiento de nanopartículas, NTA). Con TENPO, se pueden aislar múltiples subpoblaciones de vehículos eléctricos en una enfermedad (por ejemplo, vehículos eléctricos derivados de neuronas versus vehículos eléctricos derivados de astrocitos en la demencia) en un formato rápido y de bajo costo basado en chips para el análisis de carga posterior.

Caracterización del aislamiento TENPO de subpoblaciones de vehículos eléctricos. (A) Esquema del aislamiento de EV de nanoporos magnéticos grabados en pista. Los vehículos eléctricos se marcan primero con anticuerpos de captura biotinilados y luego con nanopartículas magnéticas anti-biotina (50 nm). Los complejos EV-MNP se capturan magnéticamente mientras fluyen verticalmente a través de nanoporos magnéticos paralelizados. (B) Ilustraciones de compensaciones aisladas de TENPO. El ajuste de los parámetros de diseño (diámetro de poro d, caudal ɸ y número de membranas n) da como resultado compensaciones que se pueden utilizar para adaptar TENPO para aislar subpoblaciones de EV particulares de muestras clínicas. (C) Fotografía de un chip TENPO ensamblado (izquierda) y micrografías SEM de los nanoporos magnéticos TENPO (centro y derecha) con un EV inmovilizado en el chip (derecha). (D) Un esquema del flujo de trabajo de este estudio.

Una característica clave del diseño de TENPO es que a medida que se capturan los vehículos eléctricos o cuando los poros se obstruyen, no afecta significativamente el rendimiento del dispositivo hasta que > 10% de los nanoporos magnéticos se ocluyen. Esta característica surge porque la resistencia fluídica de los nanoporos magnéticos es varios órdenes de magnitud mayor que la resistencia entre los poros y, como tal, cuando un poro está ocluido, el flujo se distribuye no solo a sus vecinos más cercanos, sino uniformemente sobre los 107 poros completos como si están conectados en un circuito paralelo27. Además, en muchas aplicaciones de aislamiento de subpoblaciones específicas de vehículos eléctricos, la subpoblación es escasa (por ejemplo, ~ 1900 vehículos eléctricos derivados de tumores/mL por mm3 de volumen tumoral para tumores con alta diseminación)28 en comparación con el número total de vehículos eléctricos. Por lo tanto, incluso en el caso de que TENPO procese 1011 vehículos eléctricos en un ml de plasma humano, se capturan varios órdenes de magnitud de vehículos eléctricos menos específicos en los ~ 107 nanoporos magnéticos de TENPO. Debido a que nuestro dispositivo clasifica los vehículos eléctricos de uno en uno, en un dispositivo cuya escala coincide con la de los vehículos eléctricos a nanoescala, puede clasificar los vehículos eléctricos basándose en la expresión cuantitativa de marcadores de superficie, similar a la citometría de flujo para la clasificación basada en células. Esto contrasta con los métodos convencionales que utilizan perlas o dispositivos de tamaño micrométrico29, donde la captura de EV está dictada por un único evento de unión. Además, los métodos anteriores de aislamiento de perlas de inmunoafinidad se han visto limitados por el requisito de que una alta proporción de vehículos eléctricos exprese una proteína diana determinada30.

Anteriormente se informó sobre una evaluación básica del desempeño de TENPO utilizando sistemas modelo simples5,31. El aislamiento de EV de la sangre basado en TENPO ha realizado tanto el diagnóstico como la detección de metástasis en el cáncer de páncreas con una precisión superior a los métodos convencionales5,6, y se ha aplicado en el diagnóstico de lesiones cerebrales traumáticas10.

En este manuscrito, describimos un estudio sistemático de los parámetros de diseño que controlan las compensaciones en el rendimiento, la recuperación objetivo de los vehículos eléctricos y el descarte de los vehículos eléctricos en segundo plano y los desechos que no son vehículos eléctricos en este enfoque. Hacemos esto combinando simulación de elementos finitos y caracterización experimental de chips TENPO para dilucidar las reglas de diseño de aislamiento de subpoblaciones EV (Fig. 1B).

1) Diámetro de poro d Las versiones anteriores de TENPO usaban un tamaño de poro de d = 600 nm para acercar el tamaño de las características del dispositivo a la escala de tamaño de los vehículos eléctricos5. Sin embargo, los tamaños de poro a nanoescala pueden dar como resultado la captura basada en el tamaño de vehículos eléctricos más grandes, como microvesículas (~ 100–1000 nm), así como fondos que no son vehículos eléctricos, como restos celulares y cuerpos apoptóticos32 (Fig. 1B). Aunque los pasos de preprocesamiento pueden hacerse más agresivos para eliminar materiales más grandes, esto corre el riesgo de perder los vehículos eléctricos objetivo. Si bien aumentar d reduce la captura basada en el tamaño para mejorar la pureza, corre el riesgo de aumentar la distancia que los complejos EV-MNP objetivo tienen que recorrer para capturarlos en el borde del poro, disminuyendo así el rendimiento del EV objetivo.

2) Tasa de flujo ɸ Al ajustar la tasa de flujo de la muestra ɸ a la que la muestra fluye a través de TENPO, se puede compensar el rendimiento de los vehículos eléctricos específicos en relación con el descarte exitoso de los vehículos eléctricos en segundo plano. Al disminuir ɸ, se requieren menos MNP enlazadas para que un EV objetivo se traslade al borde de un poro y se capture. Si bien esto aumenta el rendimiento objetivo de los vehículos eléctricos, también aumenta la captura de vehículos eléctricos en segundo plano vinculados debido a una adhesión no específica con pocas MNP. Al aumentar ɸ, se aíslan menos vehículos eléctricos de fondo débilmente etiquetados a expensas de perder más vehículos eléctricos específicos.

3) Número de membranas n Las membranas TENPO se pueden apilar en serie para aumentar la probabilidad de captura de los vehículos eléctricos objetivo, ya que cada membrana proporciona una oportunidad de captura independiente5 y, por lo tanto, aumenta el rendimiento de los vehículos eléctricos objetivo. Sin embargo, el aumento de n conduce a un aumento del volumen muerto en el chip (~ 25 µL por membrana para un dispositivo de 2,5 cm2) y a una mayor captura no específica de vehículos eléctricos de fondo débilmente etiquetados, lo que reduce la pureza.

En este trabajo, caracterizamos el efecto que tienen los parámetros variables del dispositivo (d, ɸ, n) sobre el rendimiento de la clasificación de EV selectiva por marcador de superficie utilizando TENPO (Fig. 1C). Con este fin, demostramos: (1) simulaciones de elementos finitos para revelar la escala del rendimiento del dispositivo con los parámetros del dispositivo, (2) validación experimental de estas leyes de escala del dispositivo en un sistema modelo de cáncer de páncreas, (3) evaluación comparativa de nuestro EV aislamiento a métodos estándar de oro, y (4) el aislamiento modular de subpoblaciones de EV en tres sistemas de modelos de cáncer diferentes (Fig. 1D).

Para identificar las leyes de escala que subyacen al desempeño de TENPO para la clasificación inmunomagnética, primero realizamos una simulación multifísica de elementos finitos (COMSOL) que incorpora un modelo magnetostático del gradiente del campo magnético, un modelo de flujo de microfluidos a través de nanoporos magnéticos y seguimiento de partículas. Simulaciones de vehículos eléctricos marcados inmunomagnéticamente. Sobre la base de simulaciones bidimensionales anteriores que aprovecharon la simetría radial de cada nanoporo magnético5, realizamos una simulación tridimensional. El flujo de fluido se modeló como un flujo de entrada laminar controlado por la velocidad del flujo (flujo que ingresa al canal a través de un plano de entrada encima del poro con una velocidad de flujo definida) con una condición de límite antideslizante y una condición de flujo periódico en los bordes de simulación para simular una gran rejilla de poros alrededor de un solo poro determinado. Trampas magnetoforéticas formadas en el borde del poro en dispositivos simulados desde un diámetro de poro d = 600 nm a d = 12 µm (SI Fig. 1) en un fuerte campo magnético externo ($|\overrightarrow{B}|$= 0,4 T) producible con un imán de NdFeB (diámetro = 1,5 pulgadas, altura = 0,75 pulgadas, K&J Magnetics). Comparamos las fuerzas magnetoforéticas para cada diámetro de poro con la fuerza de arrastre en el borde del poro a un caudal volumétrico típico de ɸ = 2,5 ml/h con un área de sección transversal del dispositivo de a = 2,5 cm2, para ambos vehículos eléctricos fuertemente etiquetados con 15 MNP vinculados y vehículos eléctricos débilmente etiquetados con 1 MNP vinculado. En esta simulación, encontramos que la fuerza magnetoforética vertical a 100 nm del borde del poro es mayor que la fuerza de arrastre en ~ 3 órdenes de magnitud para los vehículos eléctricos etiquetados con 15 MNP y ~ 2 órdenes de magnitud para los vehículos eléctricos etiquetados con 1 MNP (SI Fig. .2). Por lo tanto, para todos los diámetros de poro considerados, la captura de EV está determinada por si un EV se traslada magnetoforéticamente al borde del poro antes de pasar a través del poro a una velocidad dictada por el caudal volumétrico, el diámetro del poro y el número total de poros.

Utilizando las simulaciones de campo magnético y flujo de fluido descritas anteriormente, simulamos las trayectorias de EV conjugados con MNP a través de múltiples diámetros de poro d, caudales ɸ y número de membranas TENPO colocadas en la serie n. En cada simulación consideramos la trayectoria de 100 vehículos eléctricos que fluyen a través de un único nanoporo magnético desde una cuadrícula cuadrada uniforme de posiciones iniciales con una longitud dos veces el diámetro del poro y una altura de 3 µm por encima del poro. Se simularon vehículos eléctricos de 150 nm de diámetro como "fuertemente etiquetados" con 15 MNP unidos a un EV o "débilmente etiquetados" con 1 MNP unido a un EV (Fig. 2A). Las MNP de 50 nm de diámetro se modelaron basándose en nanopartículas de ferrita de óxido de hierro reticulado (CLIO) debido a su uso común y caracterización en la literatura33,34.

Simulaciones de elementos finitos para caracterizar la clasificación TENPO EV. (A) Simulaciones de seguimiento de partículas para vehículos eléctricos fuertemente etiquetados versus débilmente etiquetados a través de un único nanoporo magnético en un diámetro de poro de ejemplo d = 1 µm y un caudal volumétrico de ejemplo ɸ = 2,5 ml/h. (B) La tasa de captura de EV fuertemente etiquetados (Rs) y EV débilmente etiquetados (Rw) versus el diámetro de poro d para un caudal volumétrico ɸ = 2,5 ml/h. (C) La tasa de captura de EV fuertemente etiquetados y EV débilmente etiquetados versus el caudal volumétrico ɸ, para un diámetro de poro d = 1 µm.

Primero modelamos los efectos del diámetro de poro d en el rendimiento de TENPO modelando diámetros de poro que van desde d = 600 nm a 12 micrones, suponiendo un caudal ɸ = 2,5 ml/h, y utilizando el seguimiento de partículas para cuantificar su capacidad para aislar fuertemente Vehículos eléctricos con etiqueta versus etiqueta débil. Definimos la tasa de captura de vehículos eléctricos fuertemente etiquetados como Rs y la tasa de captura de vehículos eléctricos débilmente etiquetados como Rw; Por lo tanto, se utilizó 1-Rw para evaluar la capacidad del dispositivo para descartar con éxito vehículos eléctricos con etiquetas débiles. Para este sistema modelo, un diámetro de poro de d = 1 µm produjo la mayor separación entre Rs y Rw (Fig. 2B). Mientras que Rs disminuyó a medida que aumentó el diámetro de los poros, 1-Rw aumentó para d = 600 nm y 1 µm antes de estabilizarse en 1-Rw = 100% (Rw = 0%) en d = 3 y 12 µm. Por el contrario, Rs fue máxima al 100% en d = 600 nm y 1 µm antes de disminuir en d = 3 y 12 µm. En esta simulación, un diámetro de poro de 1 µm produjo un Rs alto = 100% y un 1-Rw = 88% moderadamente alto. Sin embargo, las muestras clínicas pueden presentar una distribución más compleja de la conjugación de MNP a EV dependiendo de la expresión de la proteína de superficie.

Utilizando nuestro modelo, luego evaluamos el efecto sobre el rendimiento de variar el número de membranas TENPO n en serie. Para modelar múltiples TENPO en serie, realizamos una simulación iterativa mediante la cual los vehículos eléctricos que no se capturan en una simulación luego se simulan pasando por un TENPO posterior con una posición inicial aleatoria, ya que la ubicación de los poros en cada membrana es independiente entre sí. Consideramos una configuración de nanoporos magnéticos (d = 3 µm a un caudal ɸ = 2,5 ml/h) que tenía un alto 1-Rw (capacidad para descartar vesículas débilmente marcadas) pero un bajo Rs (rendimiento para vesículas fuertemente marcadas) para evaluar si se podrían recuperar Rs y conservar 1-Rw con múltiples membranas. Aquí, tanto Rs como Rw aumentaron con mayor n. Rs aumentó más rápido que Rw hasta n = 2–3 membranas, lo que produjo la mayor separación entre Rs versus Rw (SI Fig. 3). La adición de más de 3 membranas aumentó Rw con mejoras decrecientes en Rs.

Luego modelamos el efecto del caudal ɸ sobre el rendimiento de los nanoporos magnéticos con un diámetro d = 1 µm, elegido por su alto Rs y su moderadamente alto 1-Rw. Para caudales ɸ <2,5 ml/h, se capturaron todos los vehículos eléctricos fuertemente etiquetados. A medida que el caudal aumentó más allá de ɸ > 2,5 ml/h, Rs disminuyó en función del caudal ɸ. A velocidades de flujo ɸ < 2,5 ml/h, 1-Rw aumentó en función de ɸ, y más allá de ɸ > 2,5 ml/h, todos los vehículos eléctricos débilmente dirigidos se descartaron con éxito. (Figura 2C). Este sistema modelo demuestra el potencial para ajustar la compensación entre Rs y 1-Rw en este escenario modelo que presenta vehículos eléctricos específicos y vehículos eléctricos fuera del objetivo con MNP vinculados no específicamente.

También consideramos el impacto de la obstrucción en el desempeño de TENPO. En TENPO, el flujo se distribuye uniformemente a través de una gran cantidad de nanoporos magnéticos (N = 5,3 × 106 d = poros de 3 µm en una membrana de 2,5 cm2). La velocidad promedio del flujo a través de un solo poro es Vz = ɸ/(N*apore), donde apora es el área de la sección transversal de un poro. El flujo tiende a distribuirse uniformemente a través de los poros, porque la resistencia al flujo calculada entre los poros es aproximadamente dos órdenes de magnitud menor que la resistencia al flujo a través de un solo poro d = 3 µm (SI Fig. 4). Debido a que los nanoporos se comportan como si estuvieran en paralelo, bloquear un solo poro obstruido da como resultado que su parte del flujo se distribuya entre los otros millones de poros que operan en paralelo en el chip, minimizando su impacto en el rendimiento general. En una simulación de elementos finitos de nueve poros que operan en paralelo dentro de una condición de flujo periódico para simular una gran red repetitiva de poros circundantes, mostramos que la fuerza de arrastre máxima para un EV que ingresa a un poro no ocluido aumenta en ~ 11% con 1 de cada 9 poros en la rejilla está completamente ocluido y es menos del doble (aumento de ~ 80 %) incluso con 4 de cada 9 poros completamente ocluidos (SI Fig. 5). Con la condición de flujo periódico, esto sugiere que el rendimiento de TENPO no cambia significativamente incluso con ~ 10% de los poros completamente ocluidos en el chip.

Para evaluar el impacto de la obstrucción en el rendimiento de un solo poro, simulamos el efecto sobre la velocidad del flujo y las trayectorias de los vehículos eléctricos fuertemente etiquetados versus los débilmente etiquetados para obstrucciones esféricas de 400 nm y 800 nm de radio en un poro de 3 µm. Observamos solo cambios limitados en los perfiles de velocidad y velocidades máximas para obstrucciones de hasta 800 nm (SI Fig. 6). También realizamos simulaciones de seguimiento de partículas en las que los poros obstruidos se desafiaron con n = 100 EV-MNP fuertemente etiquetados versus débilmente etiquetados. Rs y Rw no cambiaron para una obstrucción de 400 nm, mientras que una obstrucción de 800 nm resultó en un aumento en Rw pero en Rs sin cambios. En particular, los vehículos eléctricos fuertemente etiquetados en las obstrucciones de 400 nm y 800 nm se acumularon alrededor de la ubicación de la obstrucción, mientras que en las obstrucciones de 800 nm los vehículos eléctricos débilmente etiquetados también se acumularon alrededor de la ubicación de la obstrucción, lo que indica un mayor atrapamiento de fondo (SI Fig. 7). ).

El rendimiento de TENPO en la captura inmunomagnética de subpoblaciones de vehículos eléctricos se caracterizó experimentalmente en un sistema modelo in vitro de cáncer de páncreas. Usamos TENPO para aislar EV de medios de cultivo de células de cáncer de páncreas (250 µL, ~ 3,12 × 109 EV por NTA) añadidos a un fondo complejo de 1 ml de suero bovino fetal (FBS, 1,03 × 1010 partículas del tamaño de EV por NTA) destinado a proporcionan antecedentes adicionales de proteínas y ARN para desafiar la capacidad de clasificación de TENPO. Estudiamos el efecto sobre el rendimiento de variar el diámetro de poro d, el número de membrana n, el caudal ɸ y el área de la sección transversal de la membrana a. También comparamos los caudales de lavado en el chip (5 frente a 15 ml/h) (SI Fig. 8) y la intensidad del campo magnético (0,45 frente a 0,34 T) (SI Fig. 9), pero descubrimos que ninguno de los parámetros cambió nuestros resultados. . Para cada condición, los dispositivos se desafiaron con EV conjugados con MNP marcadas con anticuerpos pan-EV (CD9, CD63, CD81, Biolegend) para representar EV fuertemente etiquetados o MNP marcadas con anticuerpos de isotipo (IgGK1, Biolegend) para representar no específicamente Fondo etiquetado / vehículos eléctricos débilmente etiquetados. Se utilizó PCR para cinco ácidos nucleicos (KRT18, GAPDH, H3F3A, KRAS, CD635) para medir los niveles de material de ácido nucleico capturado, comparándose los valores de Cq entre las dos condiciones. Para determinar hasta qué punto los niveles de ácido nucleico se correlacionaban con la concentración de EV, realizamos una serie de experimentos de titulación de aumento en los que se agregaron diferentes concentraciones de medios con EV de cultivo de células de cáncer de páncreas a un volumen constante de plasma humano sano. A partir de estas muestras adicionales, se aislaron vehículos eléctricos mediante ultracentrifugación y luego se lisaron para cuantificar la expresión del marcador de ácido nucleico mediante PCR. Demostramos una buena correlación entre la concentración de vehículos eléctricos de cultivo de células de cáncer de páncreas potenciados y los niveles de ácido nucleico (SI Fig. 10), incluso con el aumento del fondo de plasma complejo. Esto nos permite validar las tendencias de captura de EV observadas en la simulación utilizando los cambios en los niveles de ácido nucleico entre las condiciones del dispositivo como una lectura aproximada de la captura de EV. Para cada parámetro, los resultados se analizan a continuación:

Diámetro de poro d Evaluamos chips TENPO con d = 600 nm, 1 µm, 3 µm y 12 µm. El número total de membranas (n = 5), el caudal (ɸ = 2,5 ml/h) y el área de la sección transversal del dispositivo (a = 2,5 cm2) se mantuvieron constantes. Se caracterizó la cantidad de ARN de EV aislado utilizando un cóctel pan-EV de CD9, CD63 y CD81 frente a un control de anticuerpos isotipo. El ARN derivado de EV aislado mediante el cóctel pan-EV permaneció constante para diámetros de poro d = 3 µm e inferiores y disminuyó para diámetros de poro más grandes (Fig. 3A, SI Fig. 11), de acuerdo con la tendencia predicha por simulación (Fig. 2B). Del mismo modo, el ARN de EV aislado utilizando el control de isotipo fue más alto para los diámetros de poro inferiores en d = 600 nm antes de disminuir a un mínimo en d = 3 µm y d = 12 µm (Fig. 3A, SI Fig. 11), de acuerdo con la tendencia predicha por simulación (Fig. 2B). Para considerar las diferencias en el área porosa total entre las membranas d = 600 nm en comparación con las membranas de mayor diámetro de poro, también realizamos una serie de experimentos en los que escalamos los caudales para el área porosa para mantener la velocidad del flujo por poro. constante. En este experimento, se observó la misma tendencia que se encontró sin mantener la velocidad constante (SI Fig. 12).

Caracterización experimental del aislamiento de TENPO en un sistema modelo in vitro de cáncer de páncreas. Los parámetros del dispositivo que se mantuvieron constantes durante el análisis de parámetros están etiquetados encima de cada conjunto de gráficos. Cada punto representa una réplica del dispositivo y las barras de error son de n = 2 réplicas de PCR; cada condición se ejecutó con dos réplicas de dispositivos de anticuerpos y dos réplicas de dispositivos de isotipo. El enriquecimiento por cambio de veces ζ se calculó para cada condición como 2 ^ (∆Cq) para el ∆Cq entre dispositivos de anticuerpo versus isotipo. (A) ARN de EV aislado en función de los diámetros de poro d para EV marcados con anticuerpos versus marcados con isotipo. (B) ARN de EV aislado en función del número de membrana n para EV marcados con anticuerpos versus marcados con isotipo. (C) ARN de EV aislado en función del caudal ɸ para EV marcados con anticuerpos versus marcados con isotipo. (D) ARN de EV aislado en función del área de sección transversal a para EV marcados con anticuerpos versus marcados con isotipo.

Número de membrana n: Evaluamos el efecto de apilar múltiples membranas en serie sobre la captura de EV marcados con anticuerpos versus EV marcados con isotipo. En estos experimentos, el diámetro de poro d = 3 µm, el caudal ɸ = 2,5 ml/h y el área de la sección transversal del dispositivo a = 2,5 cm2 se mantuvieron constantes. Experimentalmente, observamos un aumento en el ARN de EV objetivo recuperado a medida que aumentaba el número de membranas (Fig. 3B, SI Fig. 11), y esta tendencia fue similar a la tendencia predicha en la simulación donde la cantidad de EV objetivo capturados aumentó a medida que El número de membranas aumentó a n = 3, pero se estabilizó más allá de eso (SI Fig. 3). En contraste con el aumento previsto en el fondo de la simulación, la medición experimental de los ácidos nucleicos EV marcados con isotipo se mantuvo constante en n = 1 an = 5 membranas (Fig. 3B, SI Fig. 11). Nuestra hipótesis es que esta diferencia puede deberse a que los valores de Cq para el fondo del isotipo están más cerca del límite de detección de nuestros ensayos de PCR (valores de Cq de> 33).

Caudal ɸ Consideramos cuatro caudales diferentes: ɸ = 0,5 ml/h, 2,5 ml/h, 10 ml/h y 25 ml/h, manteniendo el diámetro de poro d = 3 µm, el número de membrana n = 3 y área de la sección transversal del dispositivo a = 2,5 cm2 constante. Como lo predijo la simulación, observamos una disminución en el ARN EV objetivo recuperado a medida que el caudal ɸ aumentó entre ɸ = 2,5 ml/h y ɸ = 10 ml/h. Sin embargo, a diferencia de la simulación, luego observamos que el ARN EV objetivo recuperado se estabilizó para velocidades de flujo ɸ > 10 ml/h en lugar de disminuir (Fig. 3C, SI Fig. 11). Esta diferencia puede deberse a diferencias en el etiquetado magnético donde los vehículos eléctricos con más de 15 MNP todavía se capturan a altos caudales. No observamos ningún cambio en el ARN de EV marcado con isotipo en ninguna de las velocidades de flujo, en contraste con la disminución prevista en el fondo en la simulación. Al igual que en la exploración del número de membrana, planteamos la hipótesis de que los valores de Cq de fondo del isotipo están más cerca del límite de detección de nuestros ensayos de PCR. Observamos la mayor diferencia entre los EV marcados con anticuerpos y los marcados con isotipo a un caudal de ɸ = 2,5 ml/h (Fig. 3C, SI Fig. 11).

Área de sección transversal: Probamos cuatro áreas de sección transversal diferentes a (diseños para todos los dispositivos mostrados en SI Fig. 13) para los dispositivos TENPO, manteniendo el diámetro de poro constante en d = 3 µm. Para mantener constante la velocidad del flujo por poro, compensamos los cambios en el área abierta total cambiando los caudales de muestra y lavado. Observamos un pequeño aumento (<1 ∆Cq) tanto en la señal EV marcada con anticuerpo como en la señal EV marcada con isotipo que aumentó al aumentar a (Fig. 3D, SI Fig. 11). También observamos una disminución en el enriquecimiento del cambio entre la señal de ácido nucleico de EV marcada con anticuerpo versus la marcada con isotipo al aumentar a (Fig. 3D, SI Fig. 11).

Se sabe que los vehículos eléctricos son heterogéneos en su tamaño y expresión de marcadores de superficie y nuestros resultados lo reflejan. La carga de ARN aislada de nuestro sistema modelo utilizando los marcadores "pan-EV" (CD9, CD63, CD81) fue significativamente (p <0,05) mayor que el control de anticuerpos de isotipo. También se observaron diferencias significativas frente al control de anticuerpos isotipo para al menos un marcador de ácido nucleico para CD9, CD63 y CD81 individualmente (p < 0,05). De los tres marcadores individuales, CD9 produjo más ARN en comparación con CD63 y CD81 (SI Fig. 14), lo que fue consistente con ELISA (SI Fig. 15). También cuantificamos la variabilidad entre ejecuciones de nuestro aislamiento TENPO. Observamos una desviación estándar <1 Cq (similar a nuestra variación de réplicas de PCR) en una comparación de aislamientos de EV pan-EV realizados en diferentes días (seis réplicas de anticuerpos y seis de isotipo) (SI Fig. 16). Un ANOVA unidireccional no reveló diferencias significativas para cada marcador dentro de cualquiera de las réplicas de anticuerpos o isotipos para KRT18 y H3F3A (p > 0,05), mientras que para GAPDH hubo una diferencia significativa entre las réplicas de anticuerpos (p = 0,014) pero no se replica el isotipo (p > .05).

Comparamos el aislamiento de TENPO EV con los métodos convencionales. Según los resultados de la sección anterior, elegimos utilizar n = 3 membranas, d = 3 µm, a = 2,5 cm2. Los chips TENPO funcionan a un caudal ɸ = 2,5 ml/h. Encontramos que la carga de ARN (KRT18, GAPDH, H3F3A, KRAS, CD63) aislada de medios de cultivo celular usando TENPO (CD9, CD63, CD81) se correlacionaba bien en PCR (R2 = 0,98) con la carga aislada usando UC (Fig. 4A). Nuestra hipótesis es que el fondo adicional no EV y los desechos celulares fueron responsables de los valores más bajos de Cq (es decir, señal de ácido nucleico adicional) observados para los EV aislados con UC en comparación con TENPO, que utilizó marcadores pan-EV cuya expresión no es necesariamente universal en todas partes. todos los vehículos eléctricos en todas las líneas celulares35. La retención adicional de antecedentes potenciales no relacionados con vehículos eléctricos en la CU está respaldada por experimentos posteriores que desafiaron a la CU versus TENPO a aislar vehículos eléctricos de plasma humano sano. Aquí, TENPO logró un agotamiento mucho mayor de albúmina, una medida convencional de fondo no EV y pureza relativa de EV36, en comparación con la UC (36× frente a 4,5×) (SI Fig. 17). Por el contrario, el número total de EV aislados, la distribución de tamaño (SI Fig. 18) y la proteína total en el aislado de EV (SI Fig. 17) fueron consistentes entre UC y TENPO. SEM de TENPO con nanoporos magnéticos d = 3 µm validó que el dispositivo capturó EV etiquetados con MNP en el borde del poro, mientras que SEM de TENPO con nanoporos magnéticos d = 600 nm identificó una mayor obstrucción (Fig. 4B). También caracterizamos los tamaños de los EV completos eluidos de TENPO con el pulldown pan-EV descrito anteriormente o con un pulldown tumoral de cinco marcadores (EpCAM, CD44v6, Tspan8, CD104, c-Met) descrito en nuestro trabajo publicado anteriormente6. Cuantificamos el aislado de EV eluido y descubrimos que el tamaño de los EV aislados con TENPO coincidía con los EV aislados con UC y los resultados de nuestro trabajo anterior con TENPO (Fig. 4C) (SI Fig. 18)5,37.

Evaluación comparativa in vitro de TENPO con tecnologías estándar de oro y en diferentes sistemas biológicos. (A) Correlación de cargas de ácido nucleico entre TENPO y UC. Cada punto corresponde a un marcador de ácido nucleico medido en los VE CD9/CD63/CD81+ aislados usando TENPO en comparación con los mismos marcadores de ácido nucleico medidos en los VE aislados usando UC. Barras de error de n = 2 réplicas de dispositivo/preparación. (B) Micrografías SEM de vehículos eléctricos capturados en TENPO. Las micrografías de la izquierda y del medio muestran un TENPO con nanoporos magnéticos d = 3 µm. La micrografía de la derecha muestra un TENPO obstruido con nanoporos magnéticos d = 600 nm. (C) Distribuciones de tamaño de los vehículos eléctricos capturados por TENPO y eluidos para su medición por NTA. (D) Comparación de ∆Cq entre los medios de cultivo de células cancerosas añadidos al plasma versus los medios de cultivo celular de control añadidos al plasma para TENPO pan-EV frente a un kit comercial pan-EV. Barras de error de n = 2 réplicas de dispositivo/preparación (dos casos, dos controles) utilizando la propagación del error. (E) Comparación de ∆Cq entre EV marcados con anticuerpos y EV marcados con control de isotipo en tres sistemas modelo diferentes de cáncer. Barras de error de n = 2 réplicas de dispositivo/preparación (dos dispositivos de anticuerpos, dos dispositivos de isotipo) mediante la propagación del error.

También comparamos la capacidad de TENPO para aislar cargas de ácido nucleico de EV a partir de antecedentes complejos representativos de muestras de pacientes humanos versus un kit comercial de aislamiento de panexosomas (Fujifilm). Desafiamos a TENPO y al kit de afinidad comercial con dos tipos de muestras diferentes. Agregamos 250 µl de medio de cultivo de células de cáncer de páncreas o 250 µl de medio de cultivo de células de control (medios no expuestos a células de cáncer de páncreas) en 750 µL de plasma humano sano. Elegimos un menú desplegable pan-EV para este experimento para que coincida mejor con las plataformas comerciales pan-EV existentes. La diferencia en las cargas de ácido nucleico de los vehículos eléctricos aislados de cada muestra mediante cada método mostró una estrecha correlación en la PCR (R2 = 0,96) entre TENPO y el kit de afinidad comercial (Fig. 4D).

Por último, demostramos la modularidad de TENPO en múltiples contextos de enfermedades. Utilizando modelos de cultivo celular de cáncer de páncreas, cáncer de hígado y cáncer de pulmón, utilizamos paneles de anticuerpos específicos de tumores derivados de la literatura para aislar vehículos eléctricos de medios de cultivo celular enriquecidos con FBS. Primero comparamos el aislamiento de EV para cada panel de anticuerpos con los controles de isotipo y observamos el enriquecimiento mediado por anticuerpos de los ácidos nucleicos derivados de EV para las tres eliminaciones de anticuerpos contra el cáncer (Fig. 4E). Luego desafiamos a TENPO con muestras de aumento que consistían en aumentos de "cáncer" con medios de cultivo de células cancerosas condicionados añadidos a plasma humano sano versus controles "saludables" con plasma humano sano enriquecido con un volumen equivalente de medios de cultivo de células no acondicionados. . En los tres cánceres, TENPO demostró fuertes ∆Cqs entre el cáncer y las muestras de plasma con picos sanos (SI Fig. 19). En conjunto, estos resultados demuestran la modularidad de TENPO, que puede utilizar anticuerpos disponibles comercialmente para una amplia variedad de objetivos para el aislamiento de subpoblaciones de EV a partir de muestras complejas.

En este trabajo, presentamos el modelado y la caracterización experimental del espacio de parámetros que controla el rendimiento de TENPO en la clasificación EV de nanoporos inmunomagnéticos paralelizados. Demostramos que al controlar el diámetro de poro d, el caudal ɸ y el número de membranas en la serie n, la recuperación de subpoblaciones de EV específicas se puede compensar con precisión con la captura de material de fondo no específico de muestras clínicas. Validamos experimentalmente la clasificación precisa de TENPO y sus leyes de escala subyacentes utilizando un sistema modelo de cáncer de páncreas. Demostramos la modularidad de este enfoque en múltiples sistemas modelo de cáncer contra múltiples controles y en métodos comerciales y convencionales.

Si bien nuestras simulaciones de elementos finitos de TENPO capturaron tendencias útiles en el desempeño de TENPO, tienen varias limitaciones. En el modelo utilizado para este trabajo, consideramos vehículos eléctricos vinculados a 15 MNP versus vehículos eléctricos vinculados a 1 MNP. En la práctica, el número de MNP por EV se presentará como una distribución única para cada aplicación. Además, una señal de ácido nucleico de un EV objetivo no es necesariamente exclusiva de una única subpoblación de EV y puede estar contenida en EV de fondo debido a la heterogeneidad de los EV y a que los ácidos nucleicos desempeñan funciones en diferentes vías biológicas. Además, los vehículos eléctricos del mismo tipo de célula diana pueden presentar una expresión heterogénea de ácidos nucleicos específicos, lo que dificulta la cuantificación de recuentos absolutos de vehículos eléctricos que expresan marcadores de superficie específicos utilizando marcadores de ácidos nucleicos. Como resultado, nos centramos principalmente en los cambios relativos entre diferentes condiciones operativas del dispositivo al comparar nuestros datos experimentales con nuestros datos de simulación. TENPO podría inclinarse hacia vehículos eléctricos más grandes que pueden unir más nanopartículas magnéticas a través de su mayor área de superficie. Esto podría optimizarse mediante el uso de nanopartículas más pequeñas para el etiquetado en comparación con las nanopartículas de 50 nm disponibles comercialmente utilizadas en este estudio. Por último, los resultados de la simulación presentados aquí analizan los parámetros individualmente, manteniendo constantes todos los demás parámetros. Esto supone que cada parámetro tiene un efecto independiente en el funcionamiento del dispositivo, sin interacción entre parámetros. Se podrían realizar más mejoras en el rendimiento si dichas interacciones se caracterizaran, potencialmente utilizando algoritmos automatizados de diseño de experimentos38.

Para que los biomarcadores derivados de vehículos eléctricos alcancen una aplicación clínica, se requieren técnicas con capacidad de fabricación y rendimiento adecuados para un gran número (n > 1000) de muestras clínicas. En virtud de su bajo costo de construcción/operación (costo de un ensayo TENPO prototipo pan-EV = ~ $35; $12 material/fabricación5, $5 anticuerpo, $18 perlas) y compatibilidad con la fabricación rollo a rollo, TENPO podría ampliarse hasta fabricación rápida de chips y al mismo tiempo tener el rendimiento para grandes cohortes clínicas. El costo de fabricación de TENPO no varía con el diámetro de los poros, a diferencia de la mayoría de los enfoques de microfluidos que se basan en la fabricación litográfica. El trabajo anterior en nuestro grupo con TENPO utilizando poros de 600 nm para aislar subpoblaciones de EV pudo producir información de diagnóstico clínicamente relevante en n = 204 muestras de cáncer de páncreas6, así como en n = 96 muestras de lesión cerebral traumática10. En estos casos, TENPO, utilizando poros de 600 nm, pudo distinguir las señales biológicas de ácido nucleico del fondo, lo que se puede mejorar aún más con la mejora de 10 veces en la especificidad frente al fondo de isotipo sugerida en este manuscrito.

El desarrollo de TENPO para aislar subpoblaciones de vehículos eléctricos a partir de muestras clínicas ofrece nuevas oportunidades en el desarrollo de biomarcadores y la comprensión de la biología de los vehículos eléctricos. A medida que los diagnósticos basados en vehículos eléctricos avanzan hacia la aplicación clínica, la literatura ha demostrado cómo la heterogeneidad de los vehículos eléctricos impulsa la biología del cáncer39, influye en el diagnóstico40,41 y modula las cargas en diferentes tipos de vehículos eléctricos42. Utilizando el aislamiento inmunomagnético mediante marcadores de superficie específicos, TENPO puede aprovechar la heterogeneidad de los vehículos eléctricos al clasificar distintas subpoblaciones de vehículos eléctricos a partir de una única muestra de paciente. Analitos como las plaquetas43, los glóbulos blancos44 y las células tumorales circulantes45 se han mostrado prometedores en el diagnóstico del cáncer, y sus subpoblaciones de vehículos eléctricos podrían ofrecer biomarcadores de cáncer únicos. Para aprovechar la diversidad de células y sus vehículos eléctricos, es importante desarrollar tecnologías de clasificación de vehículos eléctricos precisas y de alto rendimiento. Al combinar la especificidad del marcaje inmunomagnético con el rendimiento mejorado y el alto rendimiento de la paralelización, TENPO ofrece el potencial para el aislamiento rápido de biomarcadores derivados de subpoblaciones de EV para aplicaciones clínicas e investigaciones biológicas.

Las simulaciones de elementos finitos se realizaron a través de COMSOL 5.3 utilizando el módulo Campos magnéticos, sin corrientes para la simulación del campo magnético y el módulo de flujo laminar para la simulación de flujo. Luego, los resultados del campo magnético y la simulación de flujo laminar se combinaron utilizando el módulo Particle Tracking for Fluid Flow para realizar simulaciones de seguimiento de partículas. De manera similar a nuestro trabajo anterior37, las permeabilidades relativas de las capas de material en TENPO en COMSOL se configuraron para aproximar los valores de magnetización de saturación de la capa de NiFe de 200 nm en el dispositivo (~ 7900 Gauss)46 en un campo de entrada de 341.000 A/m37 . Se eligió una esfera de 200 nm de diámetro para modelar complejos EV-MNP porque su volumen era equivalente a un EV + 15 MNP de 150 nm de diámetro con un diámetro de 50 nm. La permeabilidad relativa del fluido y una capa de policarbonato de soporte de 5 µm se ajustó a la unidad. Los números de fuerza magnetoforética se determinaron utilizando los valores extraídos de simulaciones COMSOL combinados con una formulación de47. Para estas MNP, se utilizó una magnetización de saturación de 95 Am2/kg, que está dentro del rango de 80 a 100 Am2/kg informado para magnetita y maghemita48. Simulamos MNP con un núcleo de óxido de hierro de 6 nm de diámetro en una capa de material no magnético con un diámetro hidrodinámico total de 50 nm. El etiquetado diferencial de vehículos eléctricos en el chip se simuló ajustando la permeabilidad relativa del complejo EV-MNP simulado en COMSOL para los fuertemente etiquetados (15 MNP unidos, µ = 1,00089) versus los débilmente etiquetados (1 MNP unido, µ = 1,00009) condiciones en una formulación adaptada de 37. El número máximo de 15 MNP también se eligió mediante una derivación, así como mediante datos SEM que validaban que los vehículos eléctricos podían unirse a 15 MNP de 37. Para el escaneo de los diámetros de los poros a 2,5 ml/h, ajustamos la densidad de los poros para cada diámetro de poro de modo que la velocidad vertical promedio del fluido de entrada a través del poro permaneciera constante. Para escanear los tamaños de las obstrucciones, las obstrucciones se modelaron como esferas colocadas en el borde de un poro con el diámetro de la esfera sobresaliendo hacia el lumen del poro y una velocidad de flujo vertical de entrada constante.

Los medios de cultivo celular se prepararon según un protocolo detallado en nuestro trabajo anterior, que se reproduce aquí en su totalidad a través de37. Se utilizaron las líneas celulares Panc1 (cáncer de páncreas), SNU449 (cáncer de hígado) y cáncer de pulmón H322, H358, H1975, H460, H1299 y H1264; Todas las líneas celulares enumeradas se compraron en ATCC. Los medios se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (Corning), suero bovino fetal al 10 % (Sigma-Aldrich) y gentamicina 50 mg/ml (Gibco) en matraces de cultivo de 75 cm2. El cultivo se mantuvo en una incubadora a 37 °C con una atmósfera de 5% de CO2. El medio se renovó dos o tres veces por semana y las células se subcultivaron en una proporción de 1:3 o 1:4 cuando se alcanzó una confluencia del 80% al 90%. Para preparar los medios condicionados, las células se transfirieron a placas de cultivo de tejidos de 150 mm x 20 mm y se sembraron a una concentración de 1,3 x 107 células por placa. Las células se cultivaron durante 5 días en medio de crecimiento completo DMEM preparado con FBS empobrecido en exosomas. Después del período de incubación de 5 días, se recogieron los medios condicionados y se sometieron a un proceso de centrifugación de dos giros para eliminar los restos de células grandes: los medios se hicieron girar a 1600 xg durante 10 minutos (cubo oscilante, freno); el sobrenadante se aisló y se centrifugó a 3000 xg durante 10 min (cubo oscilante, freno cerrado). Luego se dividieron alícuotas de 1 ml del medio condicionado y se almacenaron a -80 °C para uso futuro.

Tanto los medios de cultivo celular como las muestras de plasma se centrifugaron primero a 1600 xg durante 10 minutos. seguido de dos giros a 3000 × g durante 10 min. para eliminar restos celulares. Luego, las muestras se procesaron mediante un centrifugado de 120 000 xg durante 2 h a 4 °C por 49 en una ultracentrífuga Beckman-Coulter Optima XL-100 K utilizando un rotor Beckman-Coulter SW28 en el núcleo de vesículas extracelulares de la Universidad de Pensilvania.

Se utilizó el kit de aislamiento de exosomas Fujifilm MagCapture™ PS Ver.2 siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para todos los pulldowns, las muestras que contenían EV se incubaron primero con los anticuerpos que se enumeran a continuación durante 20 minutos en un mezclador nutante. Luego se agregaron 50 µL de nanopartículas magnéticas ultrapuras anti-biotina (Miltenyi) para unirse a los anticuerpos biotinilados que a su vez se unieron a los vehículos eléctricos objetivo. La mezcla se realizó en un mezclador nutante durante 20 minutos adicionales antes de que los complejos EV-MNP fluyeran en el chip.

Los dispositivos se bloquearon con 700 µL de Pluronic F-127 (1% en agua DI) durante 1 h a un caudal de ɸ = 0,5 ml/h antes de un lavado con 1 ml de PBS a ɸ = 15 ml/h antes de agregar la muestra a los caudales especificados en el manuscrito. Después del flujo de muestra, el lavado se realizó con tres lavados de 700 µL de PBS a una velocidad de lavado de ɸ = 15 ml/h, a menos que se especifique lo contrario.

Se utilizaron CD9, CD63 y CD81 (Biolegend) a una concentración de anticuerpos de 1,25 µg de Ab/ml de muestra. Los tres anticuerpos compartieron el mismo control IgGK1 (Biolegend).

Se utilizaron los siguientes anticuerpos, agregando 1 µL de cada anticuerpo a nuestra muestra según nuestro trabajo publicado anteriormente6: EpCAM (Biolegend), CD104 (Thermo Fisher), c-Met (Thermo Fisher), CD44v6 (Thermo Fisher), Tspan8 (Miltenyi) . Los controles de isotipo utilizados fueron Biolegend IgGk2b (para coincidir con EpCAM, CD104) e IgGK1 (c-Met, CD44v6) junto con el control de isotipo Miltenyi REA (para coincidir con Tspan8). Las muestras se procesaron a un caudal de ɸ = 2,5 ml/h.

Se utilizaron los siguientes anticuerpos a una concentración de 1 µg de Ab/ml de muestra: EpCAM (Biolegend), CD151 (Miltenyi) y EGFR (Thermo Fisher). Los controles de isotipo utilizados fueron Biolegend IgGk2b (para coincidir con EpCAM), control de isotipo Miltenyi REA (para coincidir con CD151) y Biolegend IgGK1 (para coincidir con EGFR). En particular, el aislamiento de la subpoblación EV de cáncer de hígado requirió filtrado con una unidad de filtro de 0,45 µm (GE Whatman) para lograr una fuerte especificidad frente al control de isotipo. Las muestras se procesaron a un caudal de ɸ = 2,5 ml/h.

Se utilizaron los siguientes anticuerpos a una concentración de 1 µg de Ab/ml de muestra: EpCAM (Biolegend), EGFR (Novus, biotinilado mediante el kit de biotinilación de un solo paso de Miltenyi), CD151 (Miltenyi) y Tspan8 (Miltenyi). Los controles de isotipo utilizados fueron Biolegend IgGk2b (para coincidir con EpCAM), control de isotipo Miltenyi REA (para coincidir con CD151 y Tspan8) y Novus Rabbit IgG (para coincidir con EGFR). Las muestras se procesaron a un caudal de ɸ = 2,5 ml/h.

Se crearon modelos de aumento de cáncer versus pacientes sanos. Las muestras de "cáncer" se prepararon agregando medios que contenían cantidades predeterminadas de EV (0,25 ml—> ~ 3 × 109 EV para el cáncer de páncreas, 1 ml—> ~ 9 × 1010 para el cáncer de pulmón, 1 ml—> ~ 9 × 108 para cáncer de hígado) en plasma humano sano (0,75 ml de plasma humano sano para el cáncer de páncreas, 0,25 ml de plasma humano sano para el cáncer de pulmón y de hígado; el plasma tiene una concentración de EV de 2 × 1012 EV/ml medida mediante NTA). Se agregaron volúmenes equivalentes de medios de cultivo limpios no acondicionados (medios no expuestos a células cancerosas) a los volúmenes de plasma humano sano indicados para cada tipo de medio canceroso para preparar las muestras "saludables".

Para los experimentos de caracterización de ácidos nucleicos, los vehículos eléctricos se lisaron después del aislamiento para kits comerciales/UC o en un chip para TENPO en 700 µl de QIAzol (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizó un kit de aislamiento de ARN comercial (miRNEasy Mini Kit) y el ARN aislado se eluyó en 20 µl de agua libre de ARNasa antes de su almacenamiento a -80 °C o su uso inmediato para análisis.

Se usó el kit PrimeScript RT Reagent (Takara) para convertir ARN en ADNc siguiendo las instrucciones del fabricante, y luego dicho ADNc se ejecutó usando qPCR basada en SYBR (Bio-Rad SYBR Green Master Mix) según las instrucciones del fabricante. Para medir los marcadores de miARN, se utilizó el kit miRCury LNA RT (Qiagen) para convertir ARN en ADNc, y la siguiente PCR se realizó mediante el kit miRCury LNA SYBR Green PCR (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Los valores del umbral del ciclo (Ct) se midieron en un termociclador Bio-Rad CFX384 C1000, y el instrumento estableció automáticamente los umbrales a diez veces la desviación estándar de la fluorescencia inicial. Se utilizaron cebadores de ARNm basándose en trabajos previos de nuestro grupo5,6,37.

Para la elución de EV, el aislamiento se realizó como se describió anteriormente hasta después de los pasos de lavado con PBS. Los vehículos eléctricos capturados en TENPO se incubaron con 1 ml de tampón de elución de IgG (Thermo Fisher) mientras estaban en el imán durante 10 minutos a un caudal de ɸ = 0,5 ml/h. Luego se lavó del chip el tampón de elución de IgG que contenía vehículos eléctricos a ɸ = 2,5 ml/h antes de la neutralización con 100 µl de Tris-HCl 1 M según las instrucciones del fabricante.

El análisis de seguimiento de nanopartículas se realizó utilizando un ZetaView PMX220 Twin en el núcleo de vesículas extracelulares de la Universidad de Pensilvania. Todas las diluciones se realizaron en agua desionizada y se utilizaron para ajustar las concentraciones finales informadas en el manuscrito. Las partículas medidas en NTA se consideraron de tamaño EV si se encontraban dentro de un rango entre 45 y 255 nm.

Las membranas de grabado en pista se recubrieron con níquel-hierro según un protocolo detallado en nuestro trabajo anterior5, y se recubrieron en el Centro Singh de Nanotecnología (paneles de figuras 3A, 3B, SI Fig. 8, SI Fig. 9, SI Fig. 12 ) en la Universidad de Pensilvania o a través de un proveedor comercial (Chip Diagnostics) para todos los demás experimentos descritos. Después de la selección de diferentes materiales de membrana de grabado, los dispositivos TENPO envolventes se ensamblaron como se informó anteriormente mediante Mylar cortado con láser (VLS 2.3) y cinta adhesiva de doble cara en 5,37 con el uso de los patrones descritos en SI Fig. 13. .

Utilizamos un ELISA de EV completo que informamos anteriormente en 37 para caracterizar las proteínas de superficie en los EV aislados mediante un kit de precipitación de medios de cultivo de células de cáncer de páncreas. A continuación se reproduce el protocolo para dicho ELISA; entre cada paso, realizamos tres lavados (cinco lavados después de la adición de HRP-estreptavidina) en un tampón de lavado que consiste en PBS con Tween 20 al 0,05%. Los vehículos eléctricos que se aislaron previamente mediante un kit de precipitación comercial (Thermo Fisher) se inmovilizaron primero. utilizando un tampón de recubrimiento alcalino (0,455 g Na2CO3, 0,90 g NaHCO3, 150 ml de agua desionizada) en una placa de 96 pocillos de alta unión (Greiner) durante 2 h, seguido de un paso de bloqueo a 4 grados C durante la noche en Thermo Fisher Superblock (PBS) Búfer de bloqueo. Luego, los EV se incubaron con anticuerpos de detección biotinilados durante 1 h a una concentración de 2 µg/mL en cada pocillo de 96 placas de 200 µL antes de agregar 10 µL de HRP-estreptavidina diluida 1:16,000 (Thermo Fisher) y la lectura de la señal fluorescente. en un lector de placas (Tecan Infinite M200).

Los experimentos con microscopio electrónico de barrido se llevaron a cabo en el Centro de Microscopía de Biología Celular y del Desarrollo (Facultad de Medicina Perelman, Universidad de Pensilvania) mediante un protocolo informado previamente por nuestro grupo37 que se reproduce aquí. Después de agregar la muestra y completar los pasos de flujo y lavado de la muestra, los complejos EV-MNP se inmovilizaron en el chip. Las muestras se lavaron tres veces con tampón cacodilato de Na 50 mM, se fijaron durante 2 h con glutaraldehído al 2 % en tampón cacodilato de Na 50 mM (pH 7,3) y se deshidrataron en una serie graduada de concentraciones de etanol hasta el 100 % durante un período de 1,5 h. La deshidratación en etanol al 100% se realizó tres veces. Después del paso de etanol al 100%, las muestras deshidratadas se incubaron durante 20 minutos en HMDS al 50% en etanol, seguido de tres cambios de HMDS al 100% (Sigma-Aldrich Co.) y seguido de secado al aire durante la noche como se describió anteriormente. Luego las muestras se montaron en trozos y se recubrieron con oro paladio. Las muestras se observaron y fotografiaron utilizando un microscopio electrónico de barrido Quanta 250 FEG (FEI, Hillsboro, OR, EE. UU.) a un voltaje de aceleración de 10 kV50.

El contenido de proteína EV se midió mediante un fluorómetro Qubit 4. Para cuantificar la contaminación por albúmina, se usó un kit ELISA de albúmina comercial (Thermo Fisher) en vehículos eléctricos completos aislados de 1 ml de plasma humano usando TENPO versus ultracentrifugación. Se ajustó una curva estándar vía 51 (SI Fig. 20). El agotamiento de albúmina se calculó en relación con un valor derivado de la literatura para la concentración de albúmina en plasma humano de 4 g/dL52; a una dilución de 1:500.000, el plasma de entrada original (Zen-Bio) produjo un resultado de fluorescencia muy por encima del límite de la curva de calibración logística de 1200 ng/ml del ELISA.

Se adquirió plasma humano sano de Zen-Bio, un proveedor comercial de reactivos a base de células.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Descargar referencias

Los autores desean agradecer al Dr. Yuri Veklich por su ayuda en la realización de SEM en vehículos eléctricos aislados con TENPO y al Dr. Luca Musante por su ayuda con NTA y ultracentrifugación. Los autores desean agradecer las siguientes fuentes de financiación: subvención R21MH118170 del Instituto Nacional de Salud Mental, subvención R21CA236653 del Instituto Nacional del Cáncer, subvención 12347 del Grupo Paul G. Allen Frontiers, subvención W81XWH1920002 del Departamento de Defensa de EE. UU., subvención RM1HG010023 de los Institutos Nacionales de Salud y Instituto de Alergias y Enfermedades Infecciosas R33AI147406.

Departamento de Bioingeniería, Universidad de Pensilvania, 210 S. 33rd St., Filadelfia, PA, 19104, EE. UU.

Andrew A. Lin, Hanfei Shen, Griffin Spychalski y David Issadore

Facultad de Medicina Perelman, Universidad de Pensilvania, 3400 Civic Center Blvd., Filadelfia, PA, 19104, EE. UU.

Andrew A. Lin, Griffin Spychalski y Erica L. Carpenter

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AL y DI concibieron y planificaron los experimentos y simulaciones. AL y HS llevaron a cabo los experimentos. EC proporcionó los modelos de medios de cultivo celular de cánceres humanos utilizados en este estudio. AL y DI dirigieron la redacción del manuscrito; HS, GS y EC proporcionaron comentarios esenciales y ayudaron a darle forma al manuscrito.

Correspondencia a David Issadore.

Para revelar nuestros conflictos de intereses, el Dr. David Issadore es uno de los fundadores de Chip Diagnostics y posee acciones en la empresa. Los demás autores enumerados no tienen intereses en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Lin, AA, Shen, H., Spychalski, G. et al. Modelado y optimización de la clasificación de nanoporos inmunomagnéticos paralelizados para el aislamiento específico de marcadores de superficie de vesículas extracelulares de medios complejos. Informe científico 13, 13292 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39746-7

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Recibido: 09 de mayo de 2023

Aceptado: 30 de julio de 2023

Publicado: 16 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39746-7

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